Andrew Jackson phục vụ trong vai trò thống đốc quân sự của lãnh thổ mới vừa bị thu phục, nhưng chỉ một khoảng thời gian ngắn. Ngày 30 tháng 2 năm 1822, Hoa Kỳ nhập Đông Florida và một phần Tây Florida thành Lãnh thổ Florida. William Pope Duval trở thành vị thống đốc chính thức đầu tiên của Lãnh thổ Florida. Chẳng bao lâu sau đó thủ phủ được thiết lập tại Tallahassee nhưng chỉ sau khi di dời bộ lạc Seminole ra khỏi khu vực.[3]:63–74

Trọng tâm xung đột tại Lãnh thổ Florida là các cư dân người bản địa Seminole. Chính phủ liên bang và đa số dân định cư người da trắng mong muốn tất cả người bản địa Mỹ di dân sang miền Tây. Ngày 28 tháng 5 năm 1830, Quốc hội Hoa Kỳ thông qua đạo luật di dời người bản địa Mỹ, bắt buộc tất cả người bản địa Mỹ di chuyển về phía tây sông Mississippi.[3]:87 Đúng ra đạo luật này không có ý nghĩa gì nhiều đối với Florida nhưng nó đặt ra khung sườn cho Hiệp định Paynes Landing, được một hội đồng gồm các tù trưởng của người Seminole ký vào ngày 9 tháng 5 năm 1832. Hiệp định nói rằng tất cả người bản địa Seminole của Florida nên bị dời cư trước hạn năm 1835. Họ có ba năm để dời cư. Chính tại cuộc họp này, người nổi danh là Osceola lần đầu tiên nói đến quyết định của ông là chiến đấu chống lại hiệp định.[3]:89–95

Bắt đầu cuối năm 1835, Osceola và các đồng minh thuộc bộ lạc Seminole phát khởi một cuộc chiến tranh du kích chống lại các lực lượng Hoa Kỳ.[3]:105–110 Vô số tướng lãnh chiến đấu và thất bại vì cái nóng và bệnh tật cũng như sự thiếu hiểu biết về vùng đất này. Đến khi tướng Thomas Jesup bắt được nhiều trong số các tù trưởng chính yếu của người Seminole trong số đó có cả Osceola (chết khi đang bị giam vì bệnh) thì các trận đánh bắt đầu tan dần.[3]:137–160 Người Seminole dần dần bị cưỡng bách di cư và gần như tất cả họ đều đi khỏi ngoại trừ một nhóm nhỏ tại Everglades vào thời điểm Florida gia nhập liên bang để trở thành tiểu bang thứ 27 vào ngày 3 tháng 3 năm 1845.